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通過酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA) 準確檢測血清或血漿樣品中的干擾素 (IFN) 會受到血清或血漿中成分（如異嗜性抗體和凝血因子）的干擾。來自這些不同成分的干擾被稱為基質效應。在這種情況下，為了評估 ELISA 試劑盒的性能，將已知濃度的 IFN 添加到無 IFN 的血漿中，并確定 ELISA 檢測到的濃度與實際量之間的百分比差異。這被稱為尖峰恢復。在這項研究中，我們描述了使用在不同抗凝劑中純混合血漿中制備的參考標準曲線的相容性研究。本技術說明中還報告了我們使用不同批次的人血漿對人 IFN α 加標回收的結果。
介紹
ELISA 測定基于靶分子（分析物/抗原）與特異性識別靶標的抗體的結合。使用二抗酶聯(lián)抗體檢測抗原-抗體復合物的存在。通過添加產生可量化信號的底物獲得檢測。通過使用不同的樣品稀釋劑對已知濃度的分析物進行系列稀釋來制備標準曲線。然后使用曲線的非線性 4 參數(shù)擬合來計算相似稀釋劑中未知樣品的濃度。待測分析物可存在于不同的稀釋劑中，例如含血清的組織培養(yǎng)基、純血清、純血漿和鹽緩沖液。在待測分析物存在于血清或血漿中的情況下，由于血清蛋白、異嗜性抗體和/或凝血因子的存在，可能會干擾測定。這可能會導致檢測到誤報、漏報或高背景。在這項研究中，我們展示了通過使用 PBL 的 VeriKine Human Alpha 多亞型血清 ELISA 試劑盒 41110平均大于 70% 的低濃度人干擾素 (IFN) α 實際濃度，可在人血漿中檢測到。我們還表明，未發(fā)現(xiàn)低濃度 IFN 的假陽性和假陰性，并且不存在空白的高信號。此外，我們證明標準曲線 (500-12.5 pg/ml) 在樣品稀釋劑中預稀釋至 50% 的混合血漿中制備，或在樣品制備后稀釋的純混合血漿中制備 2 X 標準曲線 (1000-25 pg/ml)稀釋至 500-12.5 pg/ml 沒有顯著差異。
方法與分析
標準曲線是從 1000 pg/ml-25 pg/ml 的樣品稀釋液、3 批不同抗凝劑（檸檬酸鈉、EDTA 鈉和肝素鈉）中的正常人血漿和三批混合液中制備的。此外，在兩個不同批次的正常人血漿中制備了低 (30 pg/ml)、中 (300 pg/ml) 和高 (800 pg/ml) 加標物。這兩個地段不是來自游泳池中使用的地段。在此之后，將 50 μl 標準品添加到產品41110-1中提供的板上的 50 μl 樣品稀釋液中 人干擾素α血清樣品多亞型 ELISA 試劑盒。ELISA 的其余步驟按照試劑盒方案進行。在單獨的測定中，比較了 1000-25 pg/ml 混合人血漿的標準曲線和 500-12.5 pg/ml 50% 混合人血漿稀釋于樣品稀釋劑中的標準曲線。在此測定中，將混合人血漿中的 50 μl 標準品 (1000-25 pg/ml) 添加到板上的 50 μl 樣品稀釋劑中，如果是 50% 混合血漿中的標準品 (500-12.5 pg/ml)將 100 μl 直接加載到板上。每次測定完成后，在Vmax上以 450 nm 讀取板 酶標儀（Molecular Devices Corporation，CA）。針對每條曲線繪制 Y 軸上的平均 OD @ 450nm 與 X 軸上以 pg/ml 為單位的實際濃度。使用非線性 4 參數(shù)擬合生成曲線（圖 1-5）。
基于數(shù)據(jù)點的曲線擬合方程和平均 OD 值，確定每個數(shù)據(jù)點的外推濃度（反擬合濃度）。使用 SoftMax Pro 版本 5 (Molecular Devices Corporation, CA) 分析所有數(shù)據(jù)。
圖 1-3： 樣品稀釋液中 1000-25 pg/ml 的標準曲線，3 個不同批次的純血漿和使用 3 個不同批次和不同抗凝劑的純混合血漿
圖 4-5： 在樣品稀釋液中制備的 500-12.5 pg/ml 和 50% 混合血漿的標準曲線與在樣品稀釋劑中稀釋至 500-12.5 pg/ml 的純混合血漿中的 1000-25 pg/ml 的標準曲線相比較
表 1：不同抗凝劑中人血漿中人 IFN α A2a 的加標回收率百分比
| % 加標回收率 | |||
| > 矩陣 | 30皮克/毫升 | 300皮克/毫升 | 800皮克/毫升 |
| 含檸檬酸鈉的 Lot D | 61.2% | 102.2% | 91.5% |
| 含檸檬酸鈉的 Lot E | 79.1% | 122.5% | 127.5% |
| 含有 Na-EDTA 的批次 D | 60.6% | 84.7% | 76.81% |
| 含 Na-EDTA 的 Lot E | 58.6% | 86.96% | 91.23% |
| Lot D 與肝素鈉 | 91.88% | 107.68% | 94.88% |
| Lot E 與肝素鈉 | 98.76% | 105.32% | 106.53% |
| 平均的 | 75% | 101.56% | 98.1% |
從圖 1-3 可以看出，Na-EDTA 人血漿中的信號低于 Na-Citrate 和 Na-Heparin 人血漿中的信號。這種效應在混合血漿中也很明顯。肝素鈉血漿中的信號在三種抗凝劑中比較強。與樣品稀釋液中的信號相比，由于血漿中的成分，人血漿中的信號也很明顯受到抑制。從圖 4-5 中可以看出，根據(jù)平板上相應最終濃度的 IFN Alpha 的 OD，在未稀釋的混合血漿中制備了 1000-25 pg/ml 的標準曲線，其中添加了 50 μl 曲線無論使用何種抗凝血劑，50 μl 樣品稀釋液在平板上類似于在 50% 混合血漿中制備的 500-12.5 pg/ml 的標準曲線。然而，由于來自不同供體的血漿中成分的數(shù)量和差異不同，兩條曲線之間的相似程度可能因血漿批次而異。從表 1 中可以看出，低濃度加標 IFN Alpha A 2a (30 pg/ml) 的加標回收率在含 EDTA 鈉的血漿中較小，在含肝素鈉的血漿中最高。總體而言，平均加標回收率在可接受的行業(yè)標準范圍內。
結論
為了準確測定血漿中人干擾素α的濃度，未知血漿樣品必須在樣品稀釋液中按 1:2 稀釋。1:2 稀釋之前的所有預稀釋都應在含有相同抗凝劑的正常人血漿中進行。樣品的未知濃度必須從標準曲線 (1000-25 pg/ml) 中推斷出來，該標準曲線是在具有不可檢測量的內源性 IFN α 的正常人血漿中制備的，或者是一組不含內源性 IFN α 的血漿批次，并且 50 μl 曲線必須添加到板上的 50 μl 樣品稀釋液中。使用產品 41110 從人血漿中回收的加標回收率確實因血漿批次而異。為獲得最準確的結果，加標回收率應根據(jù)在含有相同抗凝劑的混合血漿中繪制的標準曲線推斷得出。產品性能 41110 在以 Na-Heparin 作為抗凝劑的血漿樣品中最好，在以 Na-EDTA 作為抗凝劑的血漿中最差。
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