流式細胞分析方案主要分為4個步驟：  

• 樣品制備：應(yīng)通過機械分離方法或化學解離技術(shù)制備單細胞懸液，如采用酶溶液或鈣螯合試劑。

• 封閉：通常采用抗Fc抗體稀釋液懸浮細胞，防止一抗非特異性結(jié)合。

• 抗體孵育：流式細胞分析的孵育步驟涉及多種組分，包括一抗、二抗、鏈霉親和素和熒光染料。

• 數(shù)據(jù)采集：大多數(shù)流式細胞儀都配備獲取和轉(zhuǎn)化細胞特征信號必需的軟件。用戶可根據(jù)自身實驗要求設(shè)定具體的軟件參數(shù)。

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除了目標細胞之外，每次進行流式細胞實驗還應(yīng)包含以下對照：

• 至少一份未染色樣品，與試樣同時進行每一步的緩沖液孵育，以優(yōu)化實驗的流速和電壓。

• 一份適當?shù)年幮詫φ諛悠?，與試樣基本相同，但用在一抗的宿主種屬中生產(chǎn)的同型對照替代試樣中的一抗。該對照用于非特異性結(jié)合二抗。

• 如有需要也可準備一份已知表達所有目標抗原的細胞組成的陽性對照，并與試樣共同孵育，但僅用單色檢測。

流式免疫檢測

同其他免疫檢測應(yīng)用一樣，流式細胞分析也可通過多種方法利用抗體探測特定的細胞基元。兩大常用方法為：直接檢測法和間接檢測法。

直接檢測法

直接檢測法是一種一步染色工藝，通過一抗特異性結(jié)合目標抗原，可直接結(jié)合支持成像或其他結(jié)合狀態(tài)檢測的分子。探測位于細胞表面的抗原時，不建議固定細胞，否則可能導致抗體探針無法接觸目標抗原。因此，在數(shù)據(jù)采集結(jié)束前保持細胞活力十分重要。如要查找直接檢測法的抗體，可采用Antibody Explorer抗體搜索工具，將Search Within（搜索范圍）設(shè)為“Primary Antibodies Only"（僅限一抗），application（應(yīng)用）選擇“flow cytometry"（流式細胞分析）。

間接檢測法

間接檢測法先用純化抗體與目標抗原孵育結(jié)合，再用熒光染料標記的二抗（特異性靶向一抗宿主同型）與一抗特異性結(jié)合，形成一抗-熒光二抗復合物。采用純化一抗搭配各種波長（或顏色）的熒光染料標記二抗（特異性針對生產(chǎn)一抗的宿主同型）可提升抗體庫的模塊化程度。