在現(xiàn)代生物技術(shù)中，當(dāng)確定生物樣品中抗原、抗體、肽、蛋白質(zhì)、激素或其他生物分子的存在和數(shù)量時(shí)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)被廣泛使用。由于其高靈敏度，它甚至可以識(shí)別最小的抗原濃度。

ELISA的敏感性歸因于其識(shí)別單一抗原-抗體復(fù)合物之間相互作用的能力。

Elisa試劑盒在持續(xù)的變化中的醫(yī)學(xué)研究和診斷領(lǐng)域。由于其非凡的準(zhǔn)確性和適應(yīng)性，這些試劑盒對(duì)于解決醫(yī)學(xué)謎題和研究新的治療方法是需要的。隨著科學(xué)好奇心和技術(shù)進(jìn)步，它們的使用已經(jīng)擴(kuò)展到包括從傳染病到癌癥生物標(biāo)記識(shí)別的各個(gè)領(lǐng)域。他們每天都有新的突破，幫助改善病人護(hù)理和革命性的醫(yī)學(xué)進(jìn)步。

酶聯(lián)免疫試劑盒在細(xì)胞因子檢測(cè)中的應(yīng)用

這ELISA技術(shù)包括各種免疫測(cè)定，它們的程序幾乎沒有區(qū)別。幾個(gè)參數(shù)，例如被檢測(cè)的抗原、可用于特定抗原的單克隆抗體以及必要的測(cè)試靈敏度，決定了使用哪種版本的ELISA。夾心法和間接ELISA是細(xì)胞因子檢測(cè)中常用的兩種方法。

1.夾心ELISA

細(xì)胞因子夾心ELISAs是敏感酶免疫測(cè)定其可以精確地鑒定和測(cè)量可溶性趨化因子和細(xì)胞因子蛋白的量。高純度的抗細(xì)胞因子抗體(捕獲抗體)用于基本的細(xì)胞因子夾心ELISA方法。這些抗體非共價(jià)吸附在塑料微孔板上。固定的抗體用于選擇性地結(jié)合在樣品中發(fā)現(xiàn)的可溶性細(xì)胞因子蛋白，所述樣品在洗板后加入到板上。

去除未結(jié)合的物質(zhì)后，使用生物素偶聯(lián)的抗細(xì)胞因子抗體(檢測(cè)抗體)來鑒定已經(jīng)收集的細(xì)胞因子蛋白。隨后是酶標(biāo)記的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白步驟。

一；一個(gè)ELISA閱讀器可用于在加入生色底物后，在可接受的光密度(OD)下，通過分光光度法簡(jiǎn)單地定量由結(jié)合的酶聯(lián)檢測(cè)試劑產(chǎn)生的有色產(chǎn)物的量。當(dāng)板閱讀器連接到計(jì)算機(jī)時(shí)，數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和再分析變得更容易。

這ELISA夾心法是高精度測(cè)量分析物的方法。這種形式可以揭示分析物的特異性和靈敏度，從固定分析物的捕獲抗體開始。當(dāng)加入帶有酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體時(shí)，三明治就像積木一樣組裝起來了。它通過識(shí)別分析物上的額外表位來完成復(fù)雜的三明治結(jié)構(gòu)。

2.間接ELISA

間接ELISA是一種二級(jí)結(jié)合抗體鑒定一級(jí)抗原特異性抗體的方法?？贵w測(cè)序協(xié)調(diào)間接Elisa中的靈敏度和信號(hào)放大。在這種結(jié)構(gòu)中，兩種抗體協(xié)同工作來?yè)魯》治鑫?。具有高特異性的第一抗體尋找分析物并形成不可逆的結(jié)合。

第二抗體然后使用酶標(biāo)記來識(shí)別并將其自身附著到原始抗體上。兩種抗體協(xié)同作用，增強(qiáng)了信號(hào)，提高了靈敏度，即使是極微量的分析物也能突顯出來。

當(dāng)用于細(xì)胞因子檢測(cè)時(shí)，間接ELISA的靈敏度高。這主要是因?yàn)榈谝豢贵w可以附著許多與酶結(jié)合的第二抗體。此外，一種酶偶聯(lián)的二抗可以識(shí)別多種一抗。這為用戶提供了根據(jù)需要在幾個(gè)ELISA中使用相同的酶偶聯(lián)的第二抗體的選擇(獨(dú)立于被檢測(cè)的抗原)

選擇合適的ELISA試劑盒

考慮以下因素將有助于您的ELISA試劑盒發(fā)揮最佳性能:

1.抗體的特異性

這為ELISA測(cè)試選擇抗體取決于特異性和親和性標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)定義，單克隆抗體結(jié)合更精確，減少了背景信號(hào)。多克隆和單克隆可以一起使用，也可以分開使用。盡管多克隆會(huì)產(chǎn)生更高的信號(hào)，但非特異性結(jié)合也會(huì)更普遍。您還需要每次都進(jìn)行廣泛的測(cè)試，因?yàn)槎嗫寺?huì)表現(xiàn)出更多的批次間差異。

術(shù)語(yǔ)“配對(duì)"描述單克隆抗體、多克隆抗體或兩種抗體的混合物，用于在實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)單一抗原。這些抗體應(yīng)該已經(jīng)通過與幾個(gè)表位結(jié)合并作為有效的“捕獲"和“檢測(cè)"對(duì)而表現(xiàn)出良好的功能。

2.靈敏度和檢測(cè)范圍

每個(gè)ELISA試劑盒都設(shè)計(jì)用于檢測(cè)不同的目標(biāo)，并具有好的功能；它們不是普遍適用的。了解您的ELISA試劑盒的靈敏度和特異性，以及每一步的精確增強(qiáng)，將提供準(zhǔn)確可靠的標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示您目標(biāo)的測(cè)量結(jié)果。

每個(gè)包裝中將包含針對(duì)每個(gè)目標(biāo)定制的試劑和ELISA緩沖液。在測(cè)試開始時(shí)，確保您了解每組參數(shù)，如抗體類型、孵育持續(xù)時(shí)間、溫度和報(bào)告系統(tǒng)。如果你事先熟悉這一點(diǎn)，它會(huì)節(jié)省你大量的時(shí)間和煩惱。

3.樣本兼容性

了解特定的ELISA試劑盒是否與您的樣品組成(基質(zhì))相容(或不相容)。試劑盒的性能通常使用各種矩陣進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果經(jīng)常出現(xiàn)在說明書和其他輔助材料中。確保您了解ELISA試劑盒在樣本(尿液、組織培養(yǎng)、血漿、血清等)的基質(zhì)中的描述。).雖然這并不一定意味著試劑盒不起作用，但它將有助于了解您是否需要更多的驗(yàn)證分析來確定它在您的興趣矩陣中的表現(xiàn)如何。

4.驗(yàn)證和質(zhì)量控制

使用質(zhì)控樣本在以下位置進(jìn)行一些測(cè)試生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的各種稀釋度充分利用你的裝備。當(dāng)你知道合適的稀釋度時(shí)，保存好你的樣品。在了解要使用的樣品和稀釋液后，您可以有效地安排您的樣品板。確保按照試劑盒的說明使用所有孔。如果根據(jù)給出的信息需要額外的檢測(cè)試劑，請(qǐng)?zhí)砑印?/span>

實(shí)驗(yàn)協(xié)議

在生成有價(jià)值和有意義的數(shù)據(jù)時(shí)，以準(zhǔn)確性和可重復(fù)性為目標(biāo)。始終牢記ELISA方案，以確保一致性、最佳性能和精確結(jié)果。以下是需要考慮的實(shí)驗(yàn)方案:

• 在開始實(shí)驗(yàn)之前，給試劑盒試劑大約30分鐘的時(shí)間，使其達(dá)到室溫或規(guī)定的溫度。
• 此外，冷凍樣品必須全解凍，凍融循環(huán)次數(shù)應(yīng)保持在低水平，不超過三次。
• 在實(shí)驗(yàn)期間和實(shí)驗(yàn)之間保持一致的環(huán)境條件，如溫度和濕度。
• 確保每一件設(shè)備，如閱讀器、

  洗板機(jī)和移液器已校準(zhǔn).

• 使用足夠的抗體。
• 使用新制備的底物溶液，在使用前儲(chǔ)存數(shù)小時(shí)。
• 在測(cè)試過程中，始終如一地處理樣品，并遵守相同的方案。
• 在操作過程中目視檢查吸頭和孔，以確保吸取、試劑添加和提取。水平應(yīng)該是一樣的。
• 為了更好地利用您的試劑，請(qǐng)?jiān)贓LISA檢測(cè)中混合批次。每個(gè)ELISA試劑盒被組裝成使得組件作為一個(gè)單元起作用。測(cè)試之間的大量混合可能會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響。
• 試劑一旦使用，切勿放回瓶中。
• 測(cè)試后，保持托盤關(guān)閉，以防止孔變干。

成功檢測(cè)細(xì)胞因子的技巧

1.樣品制備

在開始你的主要實(shí)驗(yàn)之前，用一個(gè)小樣本來確定合適的稀釋范圍。您的樣本必須符合微量滴定板測(cè)試的格式。被檢測(cè)的生物標(biāo)記物的數(shù)量總會(huì)有變化。

由于您正在尋找符合樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)，請(qǐng)使用試劑盒說明作為指南。請(qǐng)注意，含有膽紅素或其他干擾因素的樣本會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。以下樣品可用于ELISA試劑盒:細(xì)胞裂解物、血清、唾液、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清液。

2.已知濃度的滴定標(biāo)準(zhǔn)

確定濃度的滴定ELISA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于任何ELISA都是不可少的，因?yàn)樗鼈兪褂脩裟軌虼_定抗原濃度在測(cè)試樣本中。為了建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通常要留出一系列的孔，并加入已知量的a將純化的重組蛋白逐漸加入孔中.

然后，當(dāng)這些孔與測(cè)試樣品同時(shí)處理時(shí)，用戶可以從酶標(biāo)儀獲得已知蛋白質(zhì)濃度的一組參考吸光度值，以便與測(cè)試樣品的吸光度值一起使用。

之后，您可以計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線，與測(cè)試樣品進(jìn)行比較，以確定所需蛋白質(zhì)的濃度。也可以使用標(biāo)準(zhǔn)曲線來驗(yàn)證用戶進(jìn)行稀釋的準(zhǔn)確度。

3.添加底物

孔中酶的量與ELISA底物被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品。最常見的附著在抗體上的酶是堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶。正如可以假設(shè)的那樣，可以獲得針對(duì)每種酶定制的產(chǎn)生熒光或生色產(chǎn)物的各種底物。

此外，底物具有多種靈敏度，這可能會(huì)提高檢測(cè)的總靈敏度。當(dāng)選擇合適的底物和酶偶聯(lián)抗體時(shí)，您還必須考慮在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)讀取ELISA板的設(shè)備。

4.檢測(cè)和分析

一種計(jì)算ELISA靈敏度的常規(guī)方法是選擇產(chǎn)生比平均背景信號(hào)值高至少兩到三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差的信號(hào)的*低濃度的細(xì)胞因子。

特定的細(xì)胞因子和趨化因子蛋白存在于混合的細(xì)胞因子環(huán)境中，例如刺激的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液。因此，由于檢測(cè)抗體信號(hào)的酶介導(dǎo)的擴(kuò)增，夾心ELISA可以定量這些蛋白質(zhì)的生理相關(guān)量。

如何分析ELISA數(shù)據(jù)

1.成績(jī)統(tǒng)計(jì)

在ELISA過程中，未知樣品的值通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較來確定。在樣品稀釋的情況下，稀釋系數(shù)需要乘以從標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的濃度值。ELISA樣品應(yīng)總是一式三份或兩份，以提供具有足夠數(shù)據(jù)的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)驗(yàn)證。

對(duì)于每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和樣品，計(jì)算兩次或三次測(cè)量值的平均值，并減去平均零標(biāo)準(zhǔn)光密度(OD)。重復(fù)數(shù)據(jù)的變異系數(shù)(CV)不應(yīng)超過20%。

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用計(jì)算機(jī)軟件繪制平均吸光度對(duì)蛋白質(zhì)濃度的曲線，以創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。確保您遵循ELISA試驗(yàn)協(xié)議建議的數(shù)據(jù)簡(jiǎn)化技術(shù)。

已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞因子蛋白質(zhì)溶液被連續(xù)稀釋以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，該標(biāo)準(zhǔn)曲線被添加到夾心ELISA測(cè)試中。這些標(biāo)準(zhǔn)曲線也稱為“校準(zhǔn)曲線"它們通常是通過將標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞因子蛋白濃度(通常表示為ng或pg細(xì)胞因子/ml)對(duì)相應(yīng)的重復(fù)平均OD值作圖而得到的。

可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線推斷出可疑的含細(xì)胞因子樣品的濃度。ELISA計(jì)算機(jī)軟件程序有助于這一操作。為了確保OD位于標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性區(qū)域內(nèi)，請(qǐng)確保對(duì)未知樣品進(jìn)行一系列稀釋。研究人員可以選擇對(duì)他們的數(shù)據(jù)進(jìn)行各種曲線擬合分析，如線性對(duì)數(shù)、對(duì)數(shù)對(duì)數(shù)或四參數(shù)轉(zhuǎn)換，這取決于所用的ELISA試劑的種類。

如果軟件不可用，可通過在線性標(biāo)度上繪制濃度記錄與OD記錄的圖表，使ELISA數(shù)據(jù)分析線性化?；貧w分析可用于找到最佳擬合線。該過程將產(chǎn)生足夠的但不太精確的數(shù)據(jù)擬合。

3.計(jì)算變異系數(shù)

變異系數(shù)(CV)描述了標(biāo)準(zhǔn)偏差與平均值的比率，通常用百分比表示。CV計(jì)算至關(guān)重要，因?yàn)樗赡軙?huì)揭示ELISA數(shù)據(jù)中的任何差異或錯(cuò)誤。重復(fù)數(shù)據(jù)的變異系數(shù)(CV)不應(yīng)超過20%。更高的簡(jiǎn)歷意味著更多的不準(zhǔn)確和潛在的錯(cuò)誤。

ELISA常見問題的故障排除

每種ELISA都有一定的缺點(diǎn)。首先，測(cè)試樣本中存在多少目標(biāo)蛋白質(zhì)的問題。如果數(shù)量過高或過低，酶標(biāo)儀產(chǎn)生的吸光度讀數(shù)可能會(huì)分別超出或低于標(biāo)準(zhǔn)曲線的極限。因此，估計(jì)測(cè)試樣品中蛋白質(zhì)的精確數(shù)量將是一個(gè)挑戰(zhàn)。

如果讀數(shù)非常高，在將測(cè)試樣品放入板的孔中之前稀釋它。根據(jù)稀釋系數(shù)，必須修改最終數(shù)字。DIY試劑盒有時(shí)需要仔細(xì)優(yōu)化抗體濃度，以獲得良好的信噪比。

結(jié)果

各種ELISA技術(shù)已被改進(jìn)，以定量分析不同實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中的抗原水平。然而，它們背后的基本思想都是一樣的。在選擇是采用間接ELISA還是夾心ELISA時(shí)，待檢樣品的復(fù)雜性和抗原特異性抗體的可用性是關(guān)鍵考慮因素細(xì)胞因子檢測(cè).

當(dāng)確定免疫反應(yīng)的結(jié)果時(shí)，例如計(jì)算樣品中抗體的含量，可以使用間接ELISA。當(dāng)檢查復(fù)雜樣品時(shí)，其中分析物或靶抗原存在于混合樣品中，如組織裂解物或培養(yǎng)上清液，夾心ELISA是最合適的方法。