jenabioscience:Atto 425蛋白質(zhì)標(biāo)記試劑盒

Jena Bioscience由Max-Planck-Institute of Molecular Physiology(Dortmund)的一組科學(xué)家于1998年成立，利用超過(guò)25年的學(xué)術(shù)知識(shí)為100多個(gè)國(guó)家的研究和行業(yè)客戶開(kāi)發(fā)創(chuàng)新試劑。

供一般實(shí)驗(yàn)室使用。

運(yùn)輸:凝膠包裝運(yùn)輸

儲(chǔ)存條件:儲(chǔ)存在-20°C
避光儲(chǔ)存，參見(jiàn)手冊(cè)

保質(zhì)期:12個(gè)月

光譜特性:
激發(fā)最大值:λexc= 436納米發(fā)射最大值:λ全身長(zhǎng)的= 484納米消光系數(shù):ε最大= 45000摩爾-1厘米-1校正系數(shù):CF280納米 = 0.23

描述:
熒光技術(shù)已經(jīng)成為生物科學(xué)的主要工具。熒光蛋白如GFP和DsRed融合到感興趣的蛋白(POI)允許表達(dá)分析和體內(nèi)蛋白定位。然而，由于這些融合蛋白的大分子量，它們的應(yīng)用受到限制。此外，相關(guān)的分子生物學(xué)是乏味和耗時(shí)的。
共價(jià)連接到POI上的小熒光團(tuán)可能有助于克服這個(gè)問(wèn)題。半胱氨酸巰基的熒光標(biāo)記對(duì)于研究POI的結(jié)構(gòu)、功能和相互作用是優(yōu)選的。(請(qǐng)注意:Jena Bioscience提供了一個(gè)即用型試劑盒，用于用高質(zhì)量的小熒光團(tuán)標(biāo)記半胱氨酸殘基(Cat。# FP-202)用于蛋白質(zhì)活性和功能研究)。
然而，最常見(jiàn)的蛋白質(zhì)標(biāo)記方法是胺修飾。胺反應(yīng)性熒光團(tuán)如NHS-酯容易與N-末端[1]以及賴氨酸側(cè)鏈上的伯氨基反應(yīng)，形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。
這種Jena Bioscience蛋白質(zhì)標(biāo)記試劑盒設(shè)計(jì)用于用小熒光團(tuán)標(biāo)記POI的賴氨酸，產(chǎn)生熒光蛋白質(zhì)-熒光團(tuán)綴合物。它包含對(duì)1mg POI進(jìn)行10次單獨(dú)標(biāo)記反應(yīng)所需的所有試劑。

內(nèi)容:
atto 425 NHS-酯
1瓶含1毫克

二甲基甲酰胺
200微升

碳酸氫鈉
1瓶含84毫克

超純水
1毫升

儲(chǔ)存和穩(wěn)定性:
收到后，將染料儲(chǔ)存在-20°c下。其他成分可儲(chǔ)存在室溫下。如果按照建議儲(chǔ)存，Jena Bioscience保證該產(chǎn)品在12個(gè)月內(nèi)保持最佳性能。

協(xié)議:
一般注意事項(xiàng)
最佳蛋白質(zhì)濃度為10 mg/ml，其他濃度也是可能的，然而，它應(yīng)該至少為2 mg/ml，因?yàn)闃?biāo)記效率受到較低蛋白質(zhì)濃度的影響。我們建議每個(gè)標(biāo)記反應(yīng)使用大約1毫克蛋白質(zhì)。
含有伯胺如Tris和甘氨酸的緩沖液不適用于標(biāo)記反應(yīng)，必須在開(kāi)始標(biāo)記反應(yīng)前用合適的不含胺的緩沖液如PBS、MES或HEPES替換。

實(shí)驗(yàn)協(xié)議

• 加入1毫升超純水溶解碳酸氫鈉。得到的1 M溶液在4°C下至少穩(wěn)定2周。
• 向蛋白質(zhì)溶液中加入適量的碳酸氫鈉(1 M ),使最終濃度達(dá)到100 mM
• 通過(guò)添加100 μl DMF制備染料，使染料濃度達(dá)到10 mg/ml。渦旋直至NHS酯*全溶解！我們建議在使用前立即制備溶液，然而，它在-20°c下可穩(wěn)定保存兩周。無(wú)論何時(shí)處理熒光團(tuán)或共軛物，請(qǐng)?jiān)谌豕鈼l件下工作！
• 將100微升蛋白質(zhì)溶液(10毫克/毫升)和10微升染料(10毫克/毫升)加入適當(dāng)?shù)男∑恐?。小心渦旋并短暫離心，收集試管底部的反應(yīng)混合物。
• 室溫下在搖床中培養(yǎng)一小時(shí)。避光！
• 使用標(biāo)準(zhǔn)凝膠過(guò)濾柱如Sephadex G-25或類似物純化綴合物。或者，可以通過(guò)透析或合適的自旋濃縮器將游離染料從綴合物中分離出來(lái)。

請(qǐng)注意，該套件不提供蛋白質(zhì)純化材料！

共軛物的濃度
因?yàn)樵跇?biāo)記過(guò)程中，特別是在純化過(guò)程中，可能會(huì)發(fā)生一定的蛋白質(zhì)損失，所以測(cè)量綴合物的濃度對(duì)于進(jìn)一步的應(yīng)用是重要的。蛋白質(zhì)的濃度通常通過(guò)測(cè)量其在280 nm處的吸光度來(lái)確定。然而，如Atto 425的激發(fā)光譜所示，熒光染料也在280 nm處吸收，從而增加了λ280對(duì)于共軛。因此，需要一個(gè)校正系數(shù)(CF)來(lái)消除280 nm處染料的影響。
每種染料的CF在光譜數(shù)據(jù)部分給出，因此綴合物的濃度根據(jù)下式計(jì)算:

c(毫克/毫升)= ((A280［構(gòu)成動(dòng)植物的古名或拉丁化的現(xiàn)代名］最大x CF) / ε280)x MW蛋白質(zhì)

標(biāo)記度
DOL表示每分子綴合物中熒光團(tuán)分子的平均數(shù)。它是共軛物的一個(gè)重要參數(shù)，顯著地影響進(jìn)一步的應(yīng)用。對(duì)于大多數(shù)目的，每200個(gè)氨基酸大約1個(gè)熒光團(tuán)分子的DOL是理想的，也參見(jiàn)故障排除部分。
DOL的計(jì)算公式如下:

DOL = (A最大x ε280)/ ((A280［構(gòu)成動(dòng)植物的古名或拉丁化的現(xiàn)代名］最大x CF) x ε最大)

測(cè)定用Atto 488 NHS酯標(biāo)記的BSA(牛血清白蛋白)的結(jié)合物濃度和DOL的實(shí)例:
牛血清白蛋白:ε280= 42925米-1厘米-1，MW = 66，433 Da
Atto 488: λexc= 501納米，ε最大= 90，000米-1厘米-1，CF = 0.1

標(biāo)記和純化后，分別在280和501 nm測(cè)量結(jié)合物溶液的吸收。

計(jì)算綴合物濃度和DOL:

c(毫克/毫升)= ((A280［構(gòu)成動(dòng)植物的古名或拉丁化的現(xiàn)代名］最大x CF) / ε280)x MW蛋白質(zhì)
c(毫克/毫升)=((1.69-7.23 x 0.1)/42925)x 66433
c(毫克/毫升)= 1.5

DOL = (A最大x ε280)/ ((A280［構(gòu)成動(dòng)植物的古名或拉丁化的現(xiàn)代名］最大x CF) x ε最大)
DOL =(7.23 x 42925)/((1.69-7.23 x 0.1)x 90000)
DOL = 3.57

在該實(shí)驗(yàn)中，綴合物的濃度為1.5 mg/ml，大多數(shù)蛋白質(zhì)分子用三個(gè)或四個(gè)Atto 488分子標(biāo)記，相當(dāng)于每200個(gè)氨基酸有1.2個(gè)Atto 488分子。
請(qǐng)注意，結(jié)合物的濃度和DOL的光譜測(cè)定不是絕對(duì)正確的。游離染料的光譜特征與結(jié)合到POI的染料的光譜特征不全相同。此外，天然蛋白質(zhì)在280 nm處的光譜特征不同于綴合物的光譜特征。
一般來(lái)說(shuō)，這些變化小得可以忽略不計(jì)，因此，光譜測(cè)定結(jié)合物的濃度和DOL是*常用的方法[3]。
除了光譜測(cè)量之外，可以通過(guò)SDS-PAGE和隨后的凝膠熒光掃描來(lái)分析綴合物。在熒光掃描中應(yīng)該只有一條帶(由熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)組成)可見(jiàn)。如果在非常低的分子量下有一個(gè)額外的帶，結(jié)合物溶液仍然含有游離染料，必須再次純化。

結(jié)合物的儲(chǔ)存
避光！像未標(biāo)記的蛋白質(zhì)一樣儲(chǔ)存結(jié)合物。我們建議將溶液分成小份，并在-20°C或-80°C下冷凍。避免反復(fù)冷凍和解凍！

故障排除:
低效標(biāo)記

• 蛋白質(zhì)溶液的濃度

  
  

  該分析被優(yōu)化用于標(biāo)記濃度為10 mg/ml的1 mg蛋白質(zhì)。

  
  

  蛋白質(zhì)濃度高于10毫克/毫升時(shí)，按比例增加染料量。如果您的蛋白質(zhì)濃度非常低(< 1毫克/毫升)，請(qǐng)使用旋轉(zhuǎn)濃縮器以達(dá)到2毫克/毫升的最終濃度。

  
  

  標(biāo)記的效率強(qiáng)烈依賴于濃度，并且在不同的蛋白質(zhì)之間有所不同。因此，在每一種情況下，優(yōu)化可能是必要的，以獲得所需程度的標(biāo)記。
• 緩沖成分

  
  

  含有伯胺(甚至微量)的蛋白質(zhì)溶液會(huì)顯著降低標(biāo)記效率。確保你的蛋白質(zhì)被充分透析，以防它與含胺物質(zhì)接觸。
• pH值的影響

  
  

  檢查你的蛋白質(zhì)溶液的pH值！參考范圍是8.2 - 8.5。

  
  

  蛋白質(zhì)的伯氨基不能被質(zhì)子化而具有活性，因此，蛋白質(zhì)溶液的pH值必須足夠高。另一方面，NHS酯的水解速率隨著溶液的pH值而增加，導(dǎo)致非活性染料。最佳標(biāo)記結(jié)果在pH 8.3獲得。

  
  

  在pH值較低的強(qiáng)緩沖蛋白質(zhì)溶液中，100 mM碳酸氫鈉可能不足以將pH值提高到最佳值。您可以添加更多的碳酸氫鈉，直到達(dá)到最佳pH值。

注意，標(biāo)記效率不僅取決于周圍條件，還取決于蛋白質(zhì)特性。蛋白質(zhì)表面的三級(jí)結(jié)構(gòu)和由此產(chǎn)生的賴氨酸數(shù)量以及等電點(diǎn)和蛋白質(zhì)在pH 8.3下的行為起作用。

過(guò)度標(biāo)注
過(guò)度標(biāo)記的原因可能是蛋白質(zhì)表面的大量賴氨酸和/或蛋白質(zhì)在pH 8.3時(shí)的最佳特性。
為了防止過(guò)度標(biāo)記，減少染料量或增加蛋白質(zhì)濃度。你也可以減少反應(yīng)時(shí)間。

綴合物的純化
染料在水溶液中是不穩(wěn)定的NHS酯的水解速率隨著溶液的pH值而增加。因此，在每次標(biāo)記反應(yīng)中都會(huì)產(chǎn)生一定量的游離染料，需要從綴合物中分離出來(lái)。
如果純化后的結(jié)合物仍然含有微量的游離染料，將其用于第二步純化。通過(guò)SDS-PAGE檢查結(jié)合物的純度。
在游離染料濃度較高時(shí)，從綴合物中分離游離染料變得更加困難。濃度非常高時(shí)，色譜柱或膜甚至?xí)蝗玖隙氯?，因此?yīng)盡量?jī)?yōu)化標(biāo)記反應(yīng)，以降低游離染料的濃度。請(qǐng)記住，總收率受到額外純化步驟的影響。

什么樣的DOL是優(yōu)的？
作為一個(gè)基本規(guī)則，每200個(gè)氨基酸一種染料是理想的，然而，最佳的標(biāo)記程度取決于你的蛋白質(zhì)以及你的預(yù)期應(yīng)用。如果您不確定，請(qǐng)使用不同劑量的少量結(jié)合物檢查您的分析，以獲得最佳結(jié)果。
在任何情況下都要防止過(guò)度標(biāo)記，因?yàn)檫@可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集或相鄰染料的熒光猝滅。

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