Lumafluor Green RetroBeads

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原始、可靠的熒光示蹤劑

luma fluor/Green retro beads IX(100 l)luma fluor是Lumafuor公司的第一個(gè)反向示蹤產(chǎn)品，也是一個(gè)被證明有效的產(chǎn)品(該產(chǎn)品的有效性已被數(shù)百篇從無(wú)脊椎動(dòng)物到哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究論文所證實(shí))。

該示蹤劑產(chǎn)品在體內(nèi)注射時(shí)濃度高，不易擴(kuò)散，信號(hào)強(qiáng)，對(duì)活細(xì)胞或活體無(wú)毒，存活時(shí)間在一年以上。它與以下大多數(shù)示蹤劑、原位雜交檢測(cè)技術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)兼容。

Further details are presented in: Katz, L.C., Burkhalter, A., and Dreyer, W.D. Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex. Nature 310: 498-500 (1984), and Katz, L.C. and Iarovici, D.M. Green fluorescent latex microspheres: a new retrograde tracer. Neuroscience 34: 511-520 (1990).

熒光乳膠微球的使用方案 

如何供應(yīng):封閉的小瓶含有懸浮在蒸餾水中的珠子的濃縮溶液。如果紅色珠子用于神經(jīng)元路徑的逆行追蹤，溶液可以原樣使用，或者稀釋。在大鼠視覺(jué)皮層中，當(dāng)使用紅色珠子時(shí)，1:4的稀釋度似乎不會(huì)降低逆行標(biāo)記的質(zhì)量或程度。然而，對(duì)于初始實(shí)驗(yàn)，我們強(qiáng)烈建議使用全強(qiáng)度的溶液。除蒸餾水外，標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液(NaCl，KCl)也可用作稀釋劑。所提供的綠珠*全為逆行追蹤實(shí)驗(yàn)做好了準(zhǔn)備。不建議稀釋綠珠。

存儲(chǔ):珠溶液應(yīng)儲(chǔ)存在冰箱中的加濕容器中，以防止蒸發(fā)。不要凍結(jié)！被冰凍的珠子將不起作用，并且不能被解救。如果珠子變干，它們就不能被重組。這種材料沒(méi)有規(guī)定保存期限，但是，如果儲(chǔ)存得當(dāng)，可以保存幾年。

應(yīng)用:最好使用壓力注射珠子(例如，1 ml Hamilton注射器，或加壓空氣注射系統(tǒng))。對(duì)于局部回路工作，已經(jīng)通過(guò)具有30-50 μm直徑吸頭的玻璃移液管注入了非常小的體積(30-50 nl)。對(duì)于常規(guī)逆行追蹤，使用更大體積(0.1-0.3 ul)和更大直徑的移液器吸頭。然而，即使注射量很大，珠子也不會(huì)從注射部位擴(kuò)散很遠(yuǎn)(通常小于1 mm)。因此，為了標(biāo)記投射到大結(jié)構(gòu)的所有或大部分神經(jīng)元，應(yīng)該進(jìn)行幾次注射。不推薦將珠的離子電滲應(yīng)用作為遞送示蹤劑的有效手段。然而，珠子確實(shí)有一個(gè)凈負(fù)電荷。

生存時(shí)間:在大多數(shù)溫血脊椎動(dòng)物系統(tǒng)中，注射后的最短有效存活時(shí)間約為24小時(shí)。標(biāo)記強(qiáng)度隨著存活時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，最長(zhǎng)可達(dá)48小時(shí)。48小時(shí)后，沒(méi)有觀察到標(biāo)記強(qiáng)度的增加(或減少)。這些值在冷血?jiǎng)游镏锌赡苡邢喈?dāng)大的不同，建議初始存活時(shí)間為一周。最大存活時(shí)間尚未確定，但即使在14個(gè)月的存活時(shí)間后，標(biāo)簽在質(zhì)量或程度上也沒(méi)有變化。細(xì)胞可能會(huì)被*久標(biāo)記。未觀察到對(duì)動(dòng)物或神經(jīng)元的毒性作用。

定影和處理:標(biāo)準(zhǔn)固定是用0.1 M磷酸鹽緩沖液洗滌，然后用0.1 M磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中的4%多聚甲醛洗滌。戊二醛會(huì)產(chǎn)生大量的組織自體熒光，這可能會(huì)模糊珠標(biāo)記的神經(jīng)元，如果可能，應(yīng)避免使用。綠珠在戊二醛固定材料中全看不見(jiàn)。冷凍切片收集在磷酸鹽緩沖液中，固定在明膠包被的載玻片上，風(fēng)干。*全干燥后，載玻片可在二甲苯中清洗1分鐘，蓋上涂有Fluoromount或Krystalon的蓋子。Fluoromount可從Atomergic Chemetals Corp .，F(xiàn)armingdale，NY獲得；Krystalon來(lái)自新澤西州吉布森鎮(zhèn)的Harleco (EM Industries)。

短暫接觸酒精和二甲苯不會(huì)造成傷害，但長(zhǎng)時(shí)間接觸(超過(guò)5分鐘)會(huì)破壞珠子。珠子對(duì)甘油非常敏感，如果放在含甘油的溶液中會(huì)迅速褪色。在需要非*久性清潔/固定劑的情況下，水楊酸甲酯優(yōu)于甘油。如果載玻片保存在暗處，細(xì)胞中的標(biāo)記至少在一年內(nèi)不會(huì)褪色(盡管背景自發(fā)熒光可能會(huì)顯著增加)。迄今為止，在塑料包埋后保留珠標(biāo)記的嘗試尚未成功。

觀察:紅色珠子中的染料是羅丹明，因此可以使用任何為羅丹明設(shè)置的熒光濾光片。一些較舊的尼康羅丹明濾鏡組給出了非常高的背景，這可以使標(biāo)記的細(xì)胞不可見(jiàn)。Zeiss和Leitz標(biāo)準(zhǔn)羅丹明濾光片均獲得了良好的效果。對(duì)于綠珠，寬帶熒光素濾光器效果很好。黃色濾鏡組給出了更強(qiáng)烈的信號(hào)，但代價(jià)是更高的背景。窄帶熒光素濾光器將給出比寬帶濾光器弱得多的信號(hào)。

即使經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的觀察或顯微攝影，珠子也不會(huì)明顯褪色。

對(duì)于低倍率、低數(shù)值孔徑的干燥物鏡(如X4、X10)，標(biāo)簽通常不可見(jiàn)。如果細(xì)胞被強(qiáng)烈標(biāo)記，X10浸沒(méi)物鏡(數(shù)值孔徑為0.4或更大)或更高功率的干物鏡通常會(huì)顯示細(xì)胞。然而，X25浸沒(méi)物鏡通常會(huì)非常清晰地顯示出低倍率物鏡所遺漏的標(biāo)記細(xì)胞。這些警告對(duì)于綠珠來(lái)說(shuō)尤其如此。在決定實(shí)驗(yàn)無(wú)效之前，用浸沒(méi)物鏡檢查注射部位附近的切片。應(yīng)該存在大量局部標(biāo)記的細(xì)胞。

綠珠用戶(hù)的附加信息:在迄今為止所做的工作中，年輕的動(dòng)物似乎比年老的動(dòng)物更好地傳遞標(biāo)簽。此外，年輕動(dòng)物的組織自體熒光較低。因此，在涉及綠珠的實(shí)驗(yàn)中，如果可能的話(huà)，最好使用較年輕的動(dòng)物。

因?yàn)榫G珠在比紅珠更短的波長(zhǎng)下被激發(fā)，組織自體熒光是一個(gè)更大的問(wèn)題。因此，將自發(fā)熒光最小化的努力將產(chǎn)生更好的對(duì)比信號(hào)。減少自體熒光的方法包括:1)使用更薄的切片(例如30 um而不是40或50 μm)；2)使用更年輕的動(dòng)物，以及3)在蓋玻片后立即檢查切片(背景隨著時(shí)間推移而增加)。

相關(guān)產(chǎn)品信息：

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Lumafluor Green RetroBeads